گروه آموزشی زیست شناسی
 

 پایان‌نامه برای دریافت درجه‌ی کارشناسی ارشد
 

در رشته‌ زیست شناسی گرایش فیزیولوژی جانوری
 

عنوان:
 

تکامل سلولهای جرم مرحله میوتیک و پست میوتیک در طی کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی انسانی بر روی لایه تغذیه کننده و حضور غلظت های مختلف رتینوئیک اسید وBMP4
 

اساتید راهنما:
 

طوبی میرزاپور – ابوالفضل بایرامی
 

اساتید مشاور:
 

محمد رضا نوروزی – عباس نوروزی
 

دیماه 1393
 

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

-1مقدمه
 

سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی (SSC) سلولهای تمایز نیافته ای هستند که دارای توانایی خود تجدیدی و تمایز به اسپرماتوزای بالغ می باشند. این قابلیتها توسط ترکیبی از ژنها در محیط داخل سلول و سیگنالهای خارجی صادر شده از ریز محیط بیضه تامین می شود . سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تنها گروه از سلولهای بنیادی بالغ هستند که می توانند اطلاعات ژنتیکی را به نسل بعد منتقل کنند. (Mohammadi&Movahedin Mansoureh2010, Yoon et al.,2009 ) . قرار گرفتن در محیط های مختلف کاری ( از لحاظ بالا بودن دما و وجود مواد شیمیایی مختلف ) و نیز ابتلا به بیماریهای گوناگون مخصوصا سرطانهای دوران پیش بلوغ که شخص ناگزیر به استفاده از شیمی درمانی یا پرتو درمانی می باشد و یا ناهنجاریهای مادر زادی بیضه درصد سلولهای SSCs را کاهش داده و یا به کل نابود می کند. بنابراین با درمان سرطان ، باروری در مردان محدود شده است ، از این رو استخراج و انجماد مایع منی قبل از شروع پروسه درمان سرطان تنها گزینه برای حفظ باروری در تکنولوژی کمک باروری محسوب می شود، ولی میزان موفقیت این عمل پایین است وحدود 25% است(Blackhall et al., 2002). نکته دیگر اینکه این استراتژی برای بیماران در سنین قبل از بلوغ قابل انجام نمی باشد (Yeh&Nagano, 2009). بنابراین استحصال سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی از بیوپسی بیماران قبل از درمان سرطان، کشت و تکثیر آنها وسپس پیوند آنها به بیضه همان بیماران به عنوان یک روش درمانی منطقی به نظر می رسد. از آنجاییکه تعداد SSC موجود در بیضه کم است این مشکل میتواند با غنی سازی SSCها از طریق تقویت در محیط آزمایشگاهی رفع شود (Nagano, 2003). در این راستا شناسایی و جدا سازی SSC ها توسط بیومارکرها و تکثیر و غنی سازی آنها با بهبود شرایط کشت آزمایشگاهی ،به عنوان یک مرحله اساسی محسوب می شود .
حفظ و تکثیر SSC ها و القای اسپرماتوژنز در شرایط in vitro همچنین می تواند به عنوان یک استراتژی درمانی برای درمان ناباروری در مردانی باشد که در معرض اشعه درمانی یا شیمی درمانی بوده و یا ضایعات نخاعی امکان تکثیر SSC و ورود به فاز میوز را در آنها مختل کرده است(Radford et al., 1999). هدف این تحقیق، بررسی بافت بیضه بیماران مختلف و استحصال سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی از بیضه افراد نابارور مدل آزواسپرمیا و تکثیر آنها و پیدا کردن روش های مناسب جهت تمایز و برطرف کردن نقص های توقف تقسیم می باشد. اسپرماتوژنز یک فرایند پیچیده و پویا می باشد که در آن اسپرماتوگونی دیپلوئید تحت 10 تقسیم میتوز و دو تقسیم میوز تبدیل به اسپرماتوزای هاپلوئید می گردد (Russell, 1990) . این فرایند از بلوغ شروع شده و تا پایان عمر ادامه می یابد. در موش 35 روز و در انسان 64 روز به طول می انجامد (Brinster, 2002). سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی پتانسیل بی نظیری برای خود نوسازی و تولید سلولهای دختر تمایز یافته دارند (Oatley&Brinster, 2006). این سلولها بسیار منحصر به فرد هستند چراکه تنها سلول در بدن هستند که می توانند ژنها را به نسل بعد از خود منتقل کند (Brinster&Nagano,1998 ). سلولهای زاینده که وارد مرحله میوز می شوند به وسیله سلولهای سرتولی محافظت می شوند. این سلولها به سمت لومن لوله های منی ساز پیشرفت می کنند و نهایتا به اسپرم بالغ تبدیل شده و به داخل لوله ها رها می شوند (Brinster&Zimmermann, 1994).
عوامل زیادی مانند فاکتور های رشد، هورمون ها، تعامل بین سلولهای سرتولی و سلولهای ژرم فرایند اسپرم زایی را تحت تاثیر قرار می دهند. نقص در هر یک از این عوامل می تواند منجر به ناباروری شود (Brinster&Nagano, 1998).
در شرایط محیط کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تنها سلولهایی هستند که قادر به ایجاد کلنی هستند. در سیستم های کشت بدون سرم توانایی زنده ماندن آنها کاهش می یابد و در طی چند روز همه می‌میرند Kanatsu- shinohara et al., 2003. افزودن سرم و نگهداری سلولهای زاینده بر روی لایه تغدیه کننده درصد زنده ماندن آنها را افزایش می دهد همچنین افزودن سایتوکین ها و فاکتورهای رشد باعث بهبود محیط کشت و در نتیجه تکثیر وزنده ماندن این سلولها می شود. در تحقیقات اخیر استفاده از نانو فایبر در محیط کشت و تکثیر سلولهای بنیادی بر روی آنها به دلیل شباهت مورفولوژیکشان به ماتریکس خارج سلولی, بر روی سلولهای بنیادی جنینی و استخوانی مورد بررسی قرار گرفته است .
در این مطالعه تمایز سلول های بنیادی اسپرماتوگونی در شرایط vitro in در حضور و یا عدم حضور نانوفایبر PLLA و دوزهای مختلف Bmp4 و رتینویک اسید مورد بررسی قرار می گیرد. برای این منظور سلولهای SSC و سرتولی سل از بیضه افراد که آزواسپرمی غیر انسدادی دارند با روش هضم آنزیمی دو مرحله ای به دست آمده و بر روی پلیت های کشتی تکثیر می شوند. پس از گذشت سه هفته از کشت اثرات PLLA، رتینوئیک اسید و BMP4روی تمایز کلونیهای SSC به وسیله مشاهدات میکروسکوپی , تکنیک ایمنوسیتوشیمی و نیز بیان ژنهای میوتیک SCP3 و پست میوتیک ACR با بهره گرفتن از RT-PCR مورد بررسی قرار می گیرد. نتایج حاصل مورد بررسی آماری و بیوانفورماتیکی قرار خواهد گرفت.
1-2- ویژگی های کلی سلول های بنیادی
سلولهای بنیادی سلولهایی هستند که با پتانسیل تمایز به انواع دیگر سلولها و قدرت تقسیم نامحدود شناخته می شوند سلولهای بنیادی دارای دو منشا جنینی و بزرگسالان هستند. سلولهای بنیادی با منشاء مختلف از لحاظ پتانسیل تکثیر و تمایز با یکدیگر متفاوت هستند به طوری که این پتانسیل از سلولهای بنیادی جنینی به سمت سلولهای بنیادی بزرگسال کاهش می یابد. سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی جنین در مرحله بلاستوسیت بدست می آیند و سلولهای بنیادی بزرگسال از بافتهای تخصص یافته مختلف مانند مغز، مغزاستخوان، کبد، پوست، لوله گوارش، قرنیه و شبکیه چشم و نیز پالپ عاج دندان بدست می آیند. این سلولها در بزرگسالان به طور مداوم فعال هستند. در ابتدا محققین بر این باور بودند که سلولهای بنیادی بزرگسالان تنها سلولهای همان بافت را ایجاد می کنند اما امروزه اعتقاد بر این است که این سلولها توانایی تبدیل شدن به انواع مختلف سلولها را دارند. به عنوان مثال سلولهای بنیادی بزرگسال مشتق از مغز استخوان علاوه بر آنکه می توانند سلولهای خونی و ایمنی را بسازند قادرند به طور مستقیم به انواع دیگری از سلولها نظیر سلولهای ماهیچه اسکلتی، میکروگیلیا و آستروگیلیا در مغز و هپاتوسیهای کبدی نیز تمایز یابند . بر این اساس پیشنهاد شده که این سلولها می توانند در پزشکی مفید باشند (Smith, 2001).
 
1-2-1- تقسیم بندی سلول های بنیادی
بر اساس یک تعریف سلولهای بنیادی را می توان به سه گروه تقسیم بندی کرد: همه توان، پرتوان و چند توان (Wagers&Weissman, 2004). سلولهای بنیادی همه توان (Totipotent) می توانند همه ی انواع سلولهای جنین را به وجود آورند که شامل سلولهای رویانی و جفتی می شوند. در واقع این سلولها پتانسیل نامحدود دارند و