Real timePCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PCR در سال های اخیر به عنوان یک استاندارد طلائی جدید،جهت شناسایی طیف وسیعی از الگو ها مورد استفاده واقع شده است.در روش های سنتیPCR،ردیابی محصول در نقطه انتهایی انجام می شود در صورتی که در روش های Real timeعمل ردیابی محصول در حین انجام واکنش و به موازات پیشرفت آن،سیکل به سیکل انجام می گردد.در روش های سنتی PCR،بررسی محصول در مرحله ایستا و یا در نقطه انتهایی و اما در روشPCR Real timeدر طول فاز اولیه یا زود یا فاز رشد انجام می شودTichopad .,2004)).

کاربرد های Real timePCR

1-اندازه گیری میزان بیان ژن

2-بازده اثر دارو

3-شناسایی عوامل بیماری زا

4-ژنوتایپینگ

5-شناسایی موتاسیون

6-شناسایی پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدPersing et al.,2004)).

روش های سنجش با Real timePCR

به طور کلی چندین روش برای انجام PCR کمی با بهره گرفتن از Real timePCR وجود دارد) Tichopad .,2004).

فرم غیر اختصاصی

این روش با بهره گرفتن از عوامل متصل شونده به DNA مثل SYBRgreen به انجام می رسد. این رنگ از طریق جایگزینی در شکاف کوچک DNA به آن متصل می شود. از جمله مزایای این روش ارزان،راحت و حساس بودن آن است.یکی از معایب بزرگ آن این است که با اتصال به دو رشته ای هایی مثل پرایمر دایمر و دیگر باند های غیر اختصاصی ،نتایج بیشتر از غلظت اصلی برآورد می شودوبنابراین اپتیمایز کردن آن باید به صورتی باشد که پرایمر دایمر و دیگر محصولات  غیراختصاصی به حداقل ممکن برسد.برای رفع این مشکل از آنالیز منحنی ذوب  استفاده می شود.از آن جایی که SYBRgreen نمی تواند بین محصولات مختلف تفاوتی قائل باشد می توان با بهره گرفتن از منحنی ذوب تنوع محصولات را در PCR مشخص کرد. بعد از اینکه PCR به پایان رسید دستگاه قادر است نمودار ذوب هر نمونه را رسم کند. این کار به وسیله اندازه گیری تغییرات فلورسانس در دماهای مختلف صورت می گیردTichopad .,2004)).

مراحل انجام کار به این صورت است که برای ترسیم منحنی دستگاه دمای نمونه ها را در فواصل زمانی مشخص (مثلا هر10 ثانیه) به مقدار معینی تغییر می دهد.برای مثال ابتدا دستگاه دمای نمونه ها را به 94 درجه سانتیگراد می رساند.در این حالت تمام DNA ها به صورت تک رشته ای هستند و میزان سایبرگرین متصل شده حداقل است. در نتیجه میزان فلورسانس ساطع شده کم می باشد. به تدریج دستگاه دمای نمونه ها را 5/0درجه سانتی گراد کاهش داده و10 ثانیه در آن دما ثابت می ماند و در این مدت نور ساطع شده از نمونه ها توسط دستگاه اندازه گیری می شود. هم زمان با این عمل منحنی تغییرات فلورسانس بر حسب دما که همان منحنی ذوب است ترسیم می گردد(شکل1-11) Tichopad .,2004)).

در نقطه ذوب50% پیوند های هیدروژنی در DNA های دو رشته ای از هم جدا شده و میزان فلورسانس بطور ناگهانی تغییر می یابد. در این منحنی هر یک از peak ها نمایانگر یک محصول PCR است. بنابراین با آنالیز منحنی ذوب می توان وجود باندهای غیر اختصاصی و پرایمر دایمر را تشخیص داد. نرم افزار،سرعت تغییرات را به صورت RFUدر محورy و دمای دستگاه را در محورx نشان می دهد. نقاط ماکزیمم نمایانگر یک محصول PCR است.peak هایی که در دمای پایین تر هستند نشان دهنده قطعات کوچکتر هستند Tichopad .,2004)).

فرم اختصاصی

در این مدل از مکانیسم FRET استفاده می شود.در این مکانیسم پروب ها طوری طراحی می شوند که در ابتدای پروب یک رنگ فلورسانس به نام Reporter و در انتهای آن فلورسانس دیگری به نام Quencher قرار می گیرد. وقتی که Reporter و Quencherدر فاصله مولکولی نزدیک به یکدیگر قرار دارند (درحالت اتصال به پروب) نوری که به Reporter می خورد باعث ایجاد یک تابش می شود که طول موج این تابش در ناحیه تحریک Quencher بوده وQuencher ضمن جذب این نور تابشی را در طول موج بلند تر ساطع می کند که توسط دستگاه قابل ارزیابی نمی باشد. پس از جدایی Reporter و Quencherنور ساطع شده از Reporter توسط  Quencherقابل جذب نبوده و در این حالت دستگاه نور ساطع شده را به صورت فلورسانس اندازه گیری می نماید Tichopad .,2004)).

روش های تعیین کمیت با Real timePCR

یکی از مهم ترین کاربرد هایReal timePCR تعیین کمی مقدار ژن بیان شده است که به دو روش صورت می گیرد: کمیت سنجی مطلقو کمیت سنجی نسبیTichopad .,2004)).

در کمیت سنجی مطلق تعداد دقیق کپی های یک ژن مشخص می گردد در حالی که کمیت سنجی نسبی، نسبت بیان یک ژن به ژن دیگر یا به عبارتی تغییرات کمی در بیان یک ژن را نشان می دهد Tichopad .,2004)).

DNA minor groove1

Melt Curve Analysis2

Relative Fluorescence Unite1

Emission 1

Absolute Quantification2

Relative Quantification 3