واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR):

تکنیک PCR در سال 1984 توسط کری مولیس ارائه شده است و امروزه به عنوان یک ابزار مهم در فعالیت های تحقیقاتی و بالینی محسوب می شود.

PCR برای تکثیر بخش های خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار می گیرد این بخش ها ممکن است یک ژن کامل یا قسمتی از یک ژن یا سکانس های بین ژن ها باشند در بسیاری از روش های PCR قطعات DNA های هدف حداکثر 10 کیلو جفت باز(KB) دارند اگر چه در بعضی از روش های خاص قطعات بزرگتر حتی تا Kb40 را هم می توان تکثیر کرد.

بعضی از کاربردهای PCR شامل کلونینگ DNA به منظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA آنالیز عملکردی ژن ها، تشخیص بیماری های ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی در تعیین والدین و جرم شناسی و تشخیص بیماری های عفونی می باشند.

در روش PCR سیکل های دمایی ایجاد می شود ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA دو رشته DNA از هم جدا می شوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده عمل همانند سازی را انجام می دهد. DNAپلیمراز آنزیمی است که با بهره گرفتن از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA ) و رشته الگو و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است.

صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد، پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه ^/3 در مولکول DNA مورد نظر هستند. بنابراین به طور اختصاصی فقط به این مولکول ها متصل می شوند چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود در نتیجه فقط مولکول DNA هدف همانند سازی و تکثیر می گردد.

با اعمال تغییرات دمایی به طور متوالی و برنامه ریزی شده روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر می شود بنابراین تعداد مولکول های DNA به صورت تصاعدی و به نسبت 2n  افزایش    می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است مثلا یک مکولکول DNA پس از 20 سیکل به 586/047/1 مولکول تکثیر می شود. در مرحله همانند سازی برای جدا نگه داشتن دورشته DNA باید دمای محلول بالا باشد بنابراین از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده می شود. اولین آنزیم که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Polymerase Taq بود که از باکتری Thermus aquaticus بدست می آید.

مراحل PCR :

• مرحله شروع: به مدت 1 تا 9 دقیقه، دمای محلول به 94 تا 96 درجه سلسیوس رسانده می شود(اگر پلیمراز ها به حرارت مقاوم باشند تا 98 درجه سلسیوس میرسانیم) این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن حرارت در روش PCR hot- start هستند.
• مرحله واسرشت: این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت 20 تا 30 ثانیه در دمای 94 تا 98 درجه سلسیوس است در این مرحله به علت گسستن پیوند های هیدروژنی بین نوکلئوتیدها DNA الگو و پرایمر ها از هم جدا می شوند و تک رشته های DNA حاصل می گردد.
• مرحله اتصال: دمای محلول به مدت 20 تا 40 ثانیه به مدت 50 تا 65 درجه سلسیوس کاهش می یابد. در این مرحله پرایمر ها به تک رشته های DNA الگو متصل می شوند و به طور طبیعی دمای اتصال در حدود 3 الی 5 درجه سلسیوس پایین تر نقطه ی ذوب پرایمر ها است. پیوند های هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر الگو همانند سازی DNA را آغاز می کند.
• مرحله طویل شدن: دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود 75 الی 80 درجه سلسیوس است که معمولا دمای 72 درجه سلسیوس انتخاب می شود. در این مرحله آنزیم DNA پلیمراز با بهره گرفتن از  dNTPهای موجود در محلول، یک رشته DNA ی جدید را در جهت ^/5 به ^/3 و در مقابل رشته های الگو        می سازد، مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه یک هزار باز را پلیمریزه می نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می شود بنابراین در هرسیکل PCR غلظت DNA به صورت تصاعدی افزایش می یابد.
• مرحله طویل شدن: این مرحله پس از آخرین سیکل PCR به مدت 5 الی 15 دقیقه در دمای 70 الی 74 درجه انجام می شود تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.
• نگهداری نهایی:در این مرحله محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای 4 الی 15 درجه سلسیوس قابل نگهداری است.
• الکتروفورز در ژل آگارز:نهایتا می توان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی الکترفورز نمود تا صحت انجام PCR بررسی شود.